Сегодня - 23.08.2019

Маленькие черви — большие открытия

05 мая 2014

Исследовательская группа из Института биофизики СО РАН (Красноярск) совместно с коллегами из Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) расшифровали структуру ранее неизвестного светящегося вещества — люциферина, который принадлежит маленькому червячку  Fridericia heliota, обитающему в южной тайге Восточной Сибири.

Fridericia heliotaСтранные биолюминесцентные организмы были обнаружены практически случайно во время вечерней работы на биостанции Красноярского государственного университета ещё в 80-х. Тогда будущие авторы открытия, заинтересовавшись необычным свечением под ногами, нашли в земле небольших белесых червей. Приглашенный специалист — Надежда Трофимовна Залесская из московского Института эволюционной морфологиии и экологии животных им. А.Н. Северцова РАН — установила новизну вида, и сибирские черви получили свое имя — Fridericia heliota (читается: Фридериция Хелиота).

— Мы опубликовали краткое описание нового вида в 1990г. и оставили эту тему на многие годы. В Институте биофизики СО РАН мы тогда занимались исследованием бактериальной биолюминесценции, а потом несколько лет работали за рубежом. Когда вернулись в конце 90-х, и  нужно было выбрать новое направление исследований, мы решили подробнее изучить этих червей, но не ожидали, что это окажется так сложно, — рассказывает научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН кандидат биологических наук Наталья Сергеевна Родионова. — Изначально предполагали, что люминесценция Fridericia heliota будет такой же, как у обитающего в США  уже изученного крупного червя Diplocardia longa. Ведь его система в то время считалась классической и общей для всех светящихся червей в мире. Но оказалось, что сибирская фридериция, в отличие от своих собратьев, при возбуждении не выделяет люминесцентную слизь, а имеет светящиеся точки, расположенные рядами на каждом сегменте. Эта уникальность нас заинтересовала, и мы решили исследовать всё в подробностях. В 2003 году вместе с итальянским специалистом по червям Эмилией Рота сделали полное описание этого вида, дальше нужно было выяснить, как же все-таки он светится.

— Биохимический этап исследований мы начали с разделения биолюминесцентной системы на фермент и субстрат, то есть на люциферазу и люциферин, — дополняет старший научный сотрудник этой же лаборатории, кандидат биологических наук Валентин Николаевич Петушков. — Люциферин — малая молекула, которая, окисляясь, обеспечивает реакцию энергией, вследствие чего  и происходит излучение на люциферазе. Долгое время у нас это не получалось, пока не обнаружили, что система АТФ-зависима, то есть для реакции еще нужны аденозинтрифосфорная кислота и ионы магния. Подобное есть у светляков, но результаты исследований подтвердили уникальность биолюминесценции сибирского червя.

Наталья Родионова и Валентин ПетушковТолько в 2006 году ученые смогли очистить люциферин до практически гомогенного состояния и получить его ультрафиолетовый спектр. Поиск по базам данных не дал никаких результатов: не было найдено ничего похожего. Однако выделенного из червей люциферина было слишком мало для определения его химической природы даже самыми современными методами: в червях его содержится всего 0,1 микрограмма на грамм биомассы.

Дело в том, что для исследования люминесцентных систем всегда нужно большое количество материала. Например, Осаму Шимомура, получивший Нобелевскую премию за открытие структуры зеленого флуоресцентного белка (GFP), который содержится в медузах, ежедневно на протяжении многих месяцев собирал последних ведрами, чтобы получить необходимое количество биомассы. А Fridericia heliota — очень маленькие (длиной всего 15-20 мм и весом около 2 мг).

— Мы сами ходили в леса и на болота, где водятся фридериции, и собирали, — рассказывает Наталья Сергеевна. — Причем они оказались привередливыми: не во всяком лесу их можно найти, а размножаться в культуре они вообще отказались. Сначала мы приходили ночью, когда заметно свечение, отмечали эти места, а потом уже днем набирали почву, закладывая на зиму в контейнерах несколько тонн для последующей выборки фридериций. В лаборатории нужно было отделить «сорных» особей (тех, которые не светятся, но внешне очень похожи). Из года в год — тысячи, десятки тысяч червей — тяжелая, кропотливая работа.

Как говорит Наталья Сергеевна, у Валентина Николаевича появилась идея, впоследствии оказавшаяся ключевой для разгадки структуры люциферина. Он обратил внимание, что в многостадийном процессе очистки люциферина рядом с ним держатся вещества-спутники: отделить их удается лишь на заключительном этапе. Кроме похожих хроматографических характеристик,  сходными с люцифериновым оказались и УФ-спектры этих веществ, что позволило предположить и схожесть их структур. Их содержание в биомассе в десятки раз выше, чем люциферина, и ученые решили сначала расшифровать их в качестве моделей для дальнейшей работы.

Свечение Fridericia heliotaВ 2011 году, когда Сибирский Федеральный Университет выиграл мегагрант на создание Лаборатории биолюминесцентных биотехнологий под руководством нобелевского лауреата Осаму Шимомура, ученые получили возможность значительно продвинуться в своих изысканиях.

— По мегагранту мы получили прекрасное оборудование, — рассказывает Наталья Сергеевна, — кроме того, у нас сложилась сильная команда специалистов. До этого момента нам не хватало в исследовании хороших химиков — здесь помогли беседы с профессором Шимомурой и усилия исследовательской группы Ильи Ямпольского (Институт биоорганической химииим. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Первым общим успехом стало установление структур двух модельных веществ, одно из которых — Компонент Х — оказалось частью второго и также «ядром» молекулы люциферина. Параллельно этой работе шло накопление биомассы червей. В итоге собрали 90 грамм биомассы — почти 100 тысяч особей. Из этого количества удалось получить всего 5 микрограмм чистого люциферина.

— С определением структуры люциферина было много хитростей, — говорит Валентин Николаевич. — Из столь малого количества вещества удалось снять масс-спектры высокого разрешения, позволившие рассчитать брутто-формулу люциферина - C23H29N3O11, а также часть ЯМР-спектров, по которым расшифровали три фрагмента: остатки лизина, γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и уже расшифрованного ранее Компонента Х. Эту работу сделали московские коллеги Максим Дубинный и Вадим Кублицкий. Суммировав все имеющиеся данные, им удалось вычислить четвертый фрагмент молекулы — остаток щавелевой кислоты (оксалата). Пазл сложился. Однако существует десяток способов собрать пептид из этих четырех составляющих. Синтезировать все 10 — это год работы. Тогда Максим Дубинный дополнительно снял 1H  ЯМР-спектры при разных значениях рН, по результатам понял, что обе карбоксильные группы Компонента X участвуют в образовании пептидной связи, а карбоксилы лизина и ГАМК свободны. Это был второй ключевой момент в работе, который позволил сократить варианты «сборки» молекулы до четырех, различающихся порядком пептидных связей при соединении фрагментов. Группа химиков-синтетиков под руководством Ильи Ямпольского синтезировала все четыре. Один из них и оказался искомым люциферином — при добавлении его к реакционной смеси с люциферазой Fridericia heliota зарегистрировали световой сигнал! Мы проверили соответствие синтезированного варианта природному и доказали их идентичность, — заканчивает рассказ Валентин Николаевич.

15 апреля статья, в которой раскрывается структура нового люциферина, была опубликована в журнале Angewandte Chemie. Это восьмой, теперь уже известный науке, люциферин.

Свечение искусственно синтезированного аналога— Исследование биолюминесценции имеет не только фундаментальную, но и прикладную ценность. Биолюминесцентный метод анализа сравним по точности с радиоизотопным — можно детектировать практически отдельные молекулы, — рассказывает Валентин Николаевич. Новый люциферин имеет отличные шансы занять свою нишу в этой области. Во-первых, он прост в химическом синтезе: любая группа профессиональных химиков сделает такой же примерно за месяц. Наши коллеги уже синтезировали такое количество, которое из червей мы добывали бы миллион лет! Во-вторых, люциферин Fridericia heliota исключительно стабилен: при комнатной температуре в водном растворе он сохраняет свою активность годами. И в-третьих, он не токсичен.

На данный момент основные направления исследований нашей группы: структуры различных аналогов люциферина и их роль в его метаболизме и биосинтезе; определение ферментов, участвующих в этих процессах; структура продукта окисления – оксилюциферина. Уже начата работа по установлению аминокислотной последовательности люциферазы. Далее планируем получать фермент не из червей, а из рекомбинантных бактерий в неограниченном количестве — для аналитических целей. Разработка самих методов анализа тоже наша работа. Поэтому мы подали заявку на грант Российского научного фонда.

Подготовила Юлия Позднякова

Фото: 1, 3, 4 — предоставлены исследователями, 2 — Юлия Позднякова

Ваша оценка: Нет Средняя: 5 (7 votes)
Поделись с друзьями: 
 

comments powered by HyperComments

Система Orphus