Исследовательская группа из Института биофизики СО РАН (Красноярск) совместно с коллегами из Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) расшифровали структуру ранее неизвестного светящегося вещества — люциферина, который принадлежит маленькому червячку Fridericia heliota, обитающему в южной тайге Восточной Сибири.
Странные биолюминесцентные организмы были обнаружены практически случайно во время вечерней работы на биостанции Красноярского государственного университета ещё в 80-х. Тогда будущие авторы открытия, заинтересовавшись необычным свечением под ногами, нашли в земле небольших белесых червей. Приглашенный специалист — Надежда Трофимовна Залесская из московского Института эволюционной морфологиии и экологии животных им. А.Н. Северцова РАН — установила новизну вида, и сибирские черви получили свое имя — Fridericia heliota (читается: Фридериция Хелиота).
— Мы опубликовали краткое описание нового вида в 1990г. и оставили эту тему на многие годы. В Институте биофизики СО РАН мы тогда занимались исследованием бактериальной биолюминесценции, а потом несколько лет работали за рубежом. Когда вернулись в конце 90-х, и нужно было выбрать новое направление исследований, мы решили подробнее изучить этих червей, но не ожидали, что это окажется так сложно, — рассказывает научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН кандидат биологических наук Наталья Сергеевна Родионова. — Изначально предполагали, что люминесценция Fridericia heliota будет такой же, как у обитающего в США уже изученного крупного червя Diplocardia longa. Ведь его система в то время считалась классической и общей для всех светящихся червей в мире. Но оказалось, что сибирская фридериция, в отличие от своих собратьев, при возбуждении не выделяет люминесцентную слизь, а имеет светящиеся точки, расположенные рядами на каждом сегменте. Эта уникальность нас заинтересовала, и мы решили исследовать всё в подробностях. В 2003 году вместе с итальянским специалистом по червям Эмилией Рота сделали полное описание этого вида, дальше нужно было выяснить, как же все-таки он светится.
— Биохимический этап исследований мы начали с разделения биолюминесцентной системы на фермент и субстрат, то есть на люциферазу и люциферин, — дополняет старший научный сотрудник этой же лаборатории, кандидат биологических наук Валентин Николаевич Петушков. — Люциферин — малая молекула, которая, окисляясь, обеспечивает реакцию энергией, вследствие чего и происходит излучение на люциферазе. Долгое время у нас это не получалось, пока не обнаружили, что система АТФ-зависима, то есть для реакции еще нужны аденозинтрифосфорная кислота и ионы магния. Подобное есть у светляков, но результаты исследований подтвердили уникальность биолюминесценции сибирского червя.
Только в 2006 году ученые смогли очистить люциферин до практически гомогенного состояния и получить его ультрафиолетовый спектр. Поиск по базам данных не дал никаких результатов: не было найдено ничего похожего. Однако выделенного из червей люциферина было слишком мало для определения его химической природы даже самыми современными методами: в червях его содержится всего 0,1 микрограмма на грамм биомассы.
Дело в том, что для исследования люминесцентных систем всегда нужно большое количество материала. Например, Осаму Шимомура, получивший Нобелевскую премию за открытие структуры зеленого флуоресцентного белка (GFP), который содержится в медузах, ежедневно на протяжении многих месяцев собирал последних ведрами, чтобы получить необходимое количество биомассы. А Fridericia heliota — очень маленькие (длиной всего 15-20 мм и весом около 2 мг).
— Мы сами ходили в леса и на болота, где водятся фридериции, и собирали, — рассказывает Наталья Сергеевна. — Причем они оказались привередливыми: не во всяком лесу их можно найти, а размножаться в культуре они вообще отказались. Сначала мы приходили ночью, когда заметно свечение, отмечали эти места, а потом уже днем набирали почву, закладывая на зиму в контейнерах несколько тонн для последующей выборки фридериций. В лаборатории нужно было отделить «сорных» особей (тех, которые не светятся, но внешне очень похожи). Из года в год — тысячи, десятки тысяч червей — тяжелая, кропотливая работа.
Как говорит Наталья Сергеевна, у Валентина Николаевича появилась идея, впоследствии оказавшаяся ключевой для разгадки структуры люциферина. Он обратил внимание, что в многостадийном процессе очистки люциферина рядом с ним держатся вещества-спутники: отделить их удается лишь на заключительном этапе. Кроме похожих хроматографических характеристик, сходными с люцифериновым оказались и УФ-спектры этих веществ, что позволило предположить и схожесть их структур. Их содержание в биомассе в десятки раз выше, чем люциферина, и ученые решили сначала расшифровать их в качестве моделей для дальнейшей работы.
В 2011 году, когда Сибирский Федеральный Университет выиграл мегагрант на создание Лаборатории биолюминесцентных биотехнологий под руководством нобелевского лауреата Осаму Шимомура, ученые получили возможность значительно продвинуться в своих изысканиях.
— По мегагранту мы получили прекрасное оборудование, — рассказывает Наталья Сергеевна, — кроме того, у нас сложилась сильная команда специалистов. До этого момента нам не хватало в исследовании хороших химиков — здесь помогли беседы с профессором Шимомурой и усилия исследовательской группы Ильи Ямпольского (Институт биоорганической химииим. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Первым общим успехом стало установление структур двух модельных веществ, одно из которых — Компонент Х — оказалось частью второго и также «ядром» молекулы люциферина. Параллельно этой работе шло накопление биомассы червей. В итоге собрали 90 грамм биомассы — почти 100 тысяч особей. Из этого количества удалось получить всего 5 микрограмм чистого люциферина.
— С определением структуры люциферина было много хитростей, — говорит Валентин Николаевич. — Из столь малого количества вещества удалось снять масс-спектры высокого разрешения, позволившие рассчитать брутто-формулу люциферина - C23H29N3O11, а также часть ЯМР-спектров, по которым расшифровали три фрагмента: остатки лизина, γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и уже расшифрованного ранее Компонента Х. Эту работу сделали московские коллеги Максим Дубинный и Вадим Кублицкий. Суммировав все имеющиеся данные, им удалось вычислить четвертый фрагмент молекулы — остаток щавелевой кислоты (оксалата). Пазл сложился. Однако существует десяток способов собрать пептид из этих четырех составляющих. Синтезировать все 10 — это год работы. Тогда Максим Дубинный дополнительно снял 1H ЯМР-спектры при разных значениях рН, по результатам понял, что обе карбоксильные группы Компонента X участвуют в образовании пептидной связи, а карбоксилы лизина и ГАМК свободны. Это был второй ключевой момент в работе, который позволил сократить варианты «сборки» молекулы до четырех, различающихся порядком пептидных связей при соединении фрагментов. Группа химиков-синтетиков под руководством Ильи Ямпольского синтезировала все четыре. Один из них и оказался искомым люциферином — при добавлении его к реакционной смеси с люциферазой Fridericia heliota зарегистрировали световой сигнал! Мы проверили соответствие синтезированного варианта природному и доказали их идентичность, — заканчивает рассказ Валентин Николаевич.
15 апреля статья, в которой раскрывается структура нового люциферина, была опубликована в журнале Angewandte Chemie. Это восьмой, теперь уже известный науке, люциферин.
— Исследование биолюминесценции имеет не только фундаментальную, но и прикладную ценность. Биолюминесцентный метод анализа сравним по точности с радиоизотопным — можно детектировать практически отдельные молекулы, — рассказывает Валентин Николаевич. Новый люциферин имеет отличные шансы занять свою нишу в этой области. Во-первых, он прост в химическом синтезе: любая группа профессиональных химиков сделает такой же примерно за месяц. Наши коллеги уже синтезировали такое количество, которое из червей мы добывали бы миллион лет! Во-вторых, люциферин Fridericia heliota исключительно стабилен: при комнатной температуре в водном растворе он сохраняет свою активность годами. И в-третьих, он не токсичен.
На данный момент основные направления исследований нашей группы: структуры различных аналогов люциферина и их роль в его метаболизме и биосинтезе; определение ферментов, участвующих в этих процессах; структура продукта окисления – оксилюциферина. Уже начата работа по установлению аминокислотной последовательности люциферазы. Далее планируем получать фермент не из червей, а из рекомбинантных бактерий в неограниченном количестве — для аналитических целей. Разработка самих методов анализа тоже наша работа. Поэтому мы подали заявку на грант Российского научного фонда.
Подготовила Юлия Позднякова
Фото: 1, 3, 4 — предоставлены исследователями, 2 — Юлия Позднякова